Técnicas parasitológicas más comunes

INTRODUCCIÓN

LOS PROCEDIMIENTOS TÉCNICOS PARASITOLÓGICOS SON DE GRAN UTILIDAD EN EL DIAGNÓSTICO E IDENTIFICACIÓN DE LAS PARASITOSIS HUMANA, LAS QUE CONSTITUYEN UN PROBLEMA DE SALUD A NIVEL MUNDIAL Y SE ENCUENTRAN ENTRE LAS PRINCIPALES CAUSAS DE MORBILIDAD Y MORTALIDAD EN PAÍSES.

EN EL MUNDO, MILLONES DE PERSONAS ESTÁN AFECTADAS POR ESTOS ORGANISMOS, LOS CUALES ESTÁN ASOCIADOS A LA POBREZA Y A LAS MALAS CONDICIONES HIGIÉNICO-SANITARIAS, Y HAN SIDO LOS SECTORES SOCIALES MÁS DESAMPARADOS, LOS MÁS VULNERABLES.

MÉTODOS MÁS COMUNES

MÉTODO DIRECTO EN FRESCO

Introducción:                                                           

El método directo en fresco es la técnica más antigua que se conoce, en el cual se necesita menos equipo, y es el más sencillo de realizar, corresponde a las preparaciones húmedas que se hacen directamente con muestra fecal. Los exámenes ordinarios se hacen con solución salina isotónica y lugol en caso de ser preparaciones directas de heces frescas o no preservadas. Si son heces preservadas el formol servirá de diluyente. Las preparaciones no teñidas sirven para el estudio de parásitos vivos, como por ejemplo trofozoitos de protozoarios móviles, huevos de helmintos y larvas de nematodos. El lugol se usara para la búsqueda e identificación de quistes y larvas.  

El examen directo o en fresco puede revelar o no parásitos, dependiendo de la intensidad de la infección.

Material:                                                                -Aplicadores de madera o palillos

-Portaobjetos de 25 × 76 mm 

-Cubreobjetos de 22 × 22mm                                                                       -Solución salina isotónica

 -Lugol

Equipo:                                                           

-Microscopio compuesto

Método:

1.-Poner por separado sobre un portaobjeto (en cada extremo) una gota de solución salina isotónica y otra de lugol                    

2.- Tomar con el aplicador una muestra de 1-4mg de heces (en caso de contener moco y sangre, elegir esa parte)

3.-Mezclar con la solución salina isotónica

4.- Remover de la suspensión fibras y otros fragmentos sólidos                                                5.- Colocar encima el cubreobjetos                         6.- Repetir estas operaciones en la gota de lugol 7.- Deben de ser visibles a la perfección los elementos en la preparación  

8.- Examinar usando el microscopio

Medidas de seguridad:                                                              El material biológico es infectante, se recomienda el uso de detergente y agua para la limpieza del material y del área de trabajo.

Método coproparasitoscopico de concentración por flotación (Willis)

Fundamento:

Este método se basa en un principio de flotación simple, utilizando una solución de cloruro de sodio de una densidad entre 1.200 y 1.250, en la cual los quistes, huevos y larvas flotan perfectamente.

Introducción:

No obstante que varios métodos de flotación simples habían sido descritos, como el de Fullborn y el de Dobell O’Connor, fue en 1921 cuando Willis, basado en los anteriores, describió el método que lleva su nombre, el cual, dada su sencillez, se puede utilizar en trabajos de campo, ya que para realizarlo únicamente se requiere microscopio y laminillas. Actualmente ha caído en desuso siendo inclusive poco conocido  en los laboratorios de diagnóstico parasitológico.

Material y equipo:

Reactivos y soluciones:

·        Cloruro de sodio comercial. Resulta más práctico  y económico utilizar sal de cocina.

·        Solución de lugol parasitológico

·        Agua

Material:

·        Recipientes cilíndricos de aproximadamente 50 ml, de vidrio, o cualquier otro material.

·        Abatelenguas de madera

·        Portaobjetos de 76x26 mm

·        Cubreobjetos de 22x40 mm

Equipo:

·        Microscopio compuesto

Método:

·        Se colocan en el recipiente de 2 a 3 g de muestra fecal, se añade una pequeña cantidad de solución saturada de cloruro de sodio, se homogeneiza, y se agrega solución hasta el borde del recipiente.

·        Se coloca un cubreobjetos sobre la boca del recipiente, de tal modo que quede en contacto con la suspensión y se deja reposar durante 15 min.

·        Después, se toma el cubreobjetos y se coloca sobre un portaobjetos al cual se le ha puesto una gota de lugol parasitológico.

·        Se observa al microscopio con objetivo de 10 y 40x.

Recomendaciones importantes:

Debido a la concentración de la solución, la lectura de las preparaciones se debe hacer de inmediato para evitar la deformación de las estructuras parasitarias.

Medidas de seguridad:

Las correspondientes a un material biológico potencialmente infectado.

Método de concentración por centrifugación flotación (Faust)

Fundamento
Este método se basa en una combinación de los principios de flotación y gravitación. El sulfato de zinc es una solución con una densidad de 1.180° y gravitación. El sulfato de Zinc en una solución con una densidad de 1.180° Baumé, además de tener mayor peso en algunas formas de parásitos, no produce deformación de los mismos. Cuando se hace suspensión de heces en esta solución, los quistes, larvas y huevos, flotan sin sufrir alteraciones morfológicas, fenómeno que se acelera mediante centrifugación de la suspensión.

IntroducciónEn 1938 Faust y colaboradores describieron este procedimiento un método semejante, pero usando una solución saturada de cloruro de sodio, fue descrito por Lane en 1924. Actualmente, por su facilidad de manejo y por hacer una buena concentración de quistes, huevos y larvas de parásitos, el método de Faust es uno de los más utilizados en nuestro medio.

Material y equipo

Reactivos y soluciones:

·        Sulfato de zinc Q.P., seco granulada; puede emplearse
Sulfato de zinc industrial si se eliminan de la solución de sales insolubles mediante filtrado previo.

·        Solución de Lugol parasitológico

·        Agua destilada

Preparación de soluciones de trabajo

·        Solución de sulfato de Zinc: pesar 331 g de sulfato de Zinc, vaciarlos en un matraz añadiendo un litro de agua de la llave; una vez disuelto verificar la densidad con el densímetro añadiendo agua o reactivo hasta que marque 1.180° Baume.

Material:

·        Recipiente de boca ancha aproximadamente 50 ml

·        Tubos de vidrio de 13 x 100 mm

·        Gradilla

·        Embudo de 7.5 cm de diámetro

·        Gasa cortada en cuadros de 15cm de lado

·        Portaobjetos de 76 x 26 mm

·        Cubreobjetos de 22 x 22 mm

·        Aplicadores de madera

·        Asa de alambre terminada en círculo de 3 a 5 mm de diámetro y formando un ángulo recto con el resto del alambre

·        Abate lenguas de madera

Equipo:

·        Densímetro graduado de 1.100 a 1.2000° Baume

·        Centrifuga con camisa para tubos de 13 x 100 mm

·        Microscopio compuesto

Método
Técnica.

• 1.    Se hace suspensión homogénea con 1 g de material fecal y 10 ml de agua.
• 2.   Se filtra la suspensión a través de la gas colocada en el embudo, colectando el filtrado directamente del tubo.
• 3.   Se centrifugan los tubos a 3,000 rpm durante 1 minuto.
• 4.   Se decanta el sobrenadante y se suspende el sedimento con agua, agitando con un aplicador de madera. Se centrifuga nuevamente, repitiendo la misma operación hasta que el sobrenadante se observe limpio.
• 5.   Se decanta el ultimo sobrenadante, se agregan 2 o 3 ml de solución de sulfato de Zinc 1.180° Baumé, se agita con el aplicador de madera hasta suspender todo sedimento, se completa el volumen con más solución de sulfato y se centrifuga a 2,000 rpm durante un minuto.
• 6.   Con el asa de recién flameada se recoge la muestra de la película superficial que se encuentra en el menisco, dos o tres ocasiones, y se deposita sobre el portaobjetos; se añade una gota de Lugol parasitológico, se mezcla con un angulo del cubreobjetos y se cubre con el mismo
• 7.   La preparación se observa con objetivos de 10 x y 40 x.

Ø Recomendaciones importantes

Ø Es necesario verificar la densidad de la solución de sulfato de Zinc periódicamente, o de preferencia prepararla cada tercer día, según el volumen de trabajo diario.

·        La obtención de la muestra por examinar con el asa de alambre, se debe hacer en seguida de la centrifugación, pues la permanencia de las formas parasitarias por más de una hora en la solución, puede provocar su deformación y sedimentación. 

Medidas de seguridad

El material biológico con que se trabaja es potencialmente infectante, por lo que se recomienda utilizar abundante detergente y agua para el lavado del material y de la zona de trabajo.

Indicaciones y limitaciones

Este método está indicado para la detección de quistes de protozoarios y la mayoría de huevos y larvas de helmintos, aunque en los casos de huevos más pesados como la Taenia sp., trematodos y de Ascarasis infértiles, frecuentemente falla, por lo que se debe de recurrir a métodos de sedimentación.

MÉTODO COPROPARASITOSCOPICO  DE GRAHAM

(CINTA ADHESIVA)

    OBJETIVO: Encontrar por medio del raspado perianal de huevos de Enterobius vermicularis.

    INTRODUCCIÓN: Vix en 1860 recomendó por primera vez el uso de una torunda o un raspador anal para obtener el examen microscópico en busca de enterobius. Graham (1941) y Jacobs (1942) introdujeron independientemente una técnica de cinta adhesiva de celulosa Scoth para obtener huevos de Enterobius de la región perianal.

Esta técnica se basa en que la hembra adulta de Enterobius Vermicularis habitualmente no deposita sus huevos en el interior del intestino, sino que por lo general emigra durante la noche, hacia los márgenes del ano, depositando los huevo en los pliegues perianales. Es por esto que la toma debe efectuarse en la mañana indicando que debe ir a defecar y no debe bañarse.

Ocasionalmente se pueden encontrar huevos de Ascaris lumbricoides, Trichiuris trichiura, Hymenolepis nana, Taenia sp.

    MATERIAL Y EQUIPO:

·        Portaobjetos de 26 x 76 mm

·        Abatelenguas

·        Cinta de celulosa Scotch

·        Microscopio

    METODO:

1.    Sobre un extremo del abatelenguas se coloca la cinta Scotch con la parte adherente hacia fuera, sujetándola con los dedos pulgar e índice.

2.   Se presiona la superficie sobre la región perianal hacia uno y otro lado, finalmente se hace un frote perianal.

3.   Separar cuidadosamente la cinta del abatelenguas y adherirlo sobre un portaobjetos.

4.   Observar con el objetivo de 10 x.

    CONSIDERACIONES: En la parasitación de Enterobius vermicularis no se buscaran huevos en las heces sino en los márgenes del ano, que es donde la hembra va a depositarlos.

    OBSERVACIÓN Y TRANSPORTE: Mantener a temperatura ambiente hasta su envío al laboratorio de Microbiología.

Método de frotis grueso.

(Kato y Miura)

Introducción

En 1954 Kato y Miura introdujeron la técnica de estudio de frotis grueso con buen resultado para contar huevos de helmintos. Martin y Beaver en 1968 desarrollaron modificaciones a esta técnica con lo que les permitió: retirar fibras de la materia fecal, hacer una extensión uniforme del frotis y evitar aclaración excesiva de la preparación. Estudios comparativos con otros métodos coproparasitoscópicos han demostrado que la técnica de frotis grueso es digna de confiar, para el diagnóstico cuantitativo de helmintos.

Fundamento

Este método se basa en la acción que tiene la glicerina como aclarador de los huevos de helmintos y el verde de malaquita como colorante de contraste.

Material y equipo

Sustancias y reactivos.

·        Glicerina.

·        Verde de malaquita.

·        Agua.  

    

     Preparación de reactivos.

·        Solución verde de malaquita al 3%

Se pesan 3 gr de verde de malaquita y se disuelven en 100 ml de agua destilada.

·        Solución de verde de malaquita y glicerol.

Glicerina pura-----------------100%

Agua---------------------------100%

Sal. Acuosa de verde de malaquita al 3% 1 ml

 Material

·        Aplicadores de madera.

·        Malla de alambre de acero inoxidable de cuadro de 4 cm por lado.

·        Portaobjetos de 38 x 76 ó de 26 x 76 mm.

·    Papel celofán de grosor medio, no resistente a la humedad, recortarlo en cuadros de 22 x 40 o 22 x 30 mm.

·        Solución de verde de malaquita al 3%.

·        Glicerina.

Equipo.

·        Microscopio compuesto.

Método

 Toma de la muestra.

 Conservación.

Técnica

• 1.    Se toma 50 mg de materia fecal con un aplicador de madera y se depositan sobre un portaobjeto. En caso de que la materia fecal contenga fibras o residuos gruesos, se toman de 2  a 3 g del producto, se colocan sobre una superficie desechable y sobre la muestra se superpone una malla metálica de alambre, que se presione por tamizar la muestra.
• 2.   Una vez que la muestra se encuentra sobre el portaobjeto se cubre con el cuadrado de celofán previamente embebido con la solución de glicerol con verde de malaquita al 3%.
• 3.   Se invierte la  preparación y se deja reposar durante una hora a área aproximadamente de 25 mm.
• 4.   Se invierte la preparación y se deja reposar durante una hora a temperatura ambiente o durante 30 minutos a 37°C.
• 5.   Observación lista para ver al microscopio.
• 6.   Se deberá observar toda la preparación y contar todos los huevos de helmintos que en ella aparezcan. 

Recomendaciones de la técnica.

Debe evitarse excederse el tiempo de aclaración porque esto dificultaría la observación de los huevos de helmintos. Si fuese necesario demorar la observación puede detenerse el proceso de aclaración  invirtiendo la preparación, es decir colocarla con el papel celofán hacia abajo hasta el momento que se vaya a observar.

Cálculos.

El total de huevos observadores en la preparación se deberán multiplicar por un factor constante de 20 y el producto será la cifra a reportar.

Informes de resultados. 

El resultado se expresa en huevos por gramo de heces.

Medidas de seguridad.

Es importante considerar que el material biológico que se maneja es potencialmente infectante por lo que es recomendable someter el material utilizando a la acción de germicidas energéticos.

"Método de Ritchie"

Introducción.

En 1917 Carles y Barthelemy descubrieron el primer método de concentración por sedimentación utilizando solución salina, éter y formaldehído. El método de Ritchie es utilizando para el diagnóstico de parasitosis intestinales leves o moderadas.

Tiene la ventaja de concentrar bien los quistes y huevecillos. No importa la densidad de los parásitos.

Fundamento.

El empleo de éter y formaldehído, permite con el primero, liberar las formas parasitarias de las grasas, por disolución de las mismas, y con el formol se fijan y conservan. La concentración se hace por centrifugaciones sucesivas.

Material.

-Cloruro de sodio Q.P.

-Formaldehído en solución Q. P.( 37.55%).

-Éter etílico comercial.

-Tubos para centrifuga cónicos de 15 ml.

-Gasa cortada en cuadros de 15 cm por lado.

-Embudos de 5 cm de diámetro.

-Vasos de precipitados de 50 ml.

-Aplicadores de madera.

-Lugol parasitológico.

-Pipetas Pasteur.

-Portaobjetos.

-Cubreobjetos.

-Microscopio compuesto

Equipo.

-Microscopio compuesto.

Método.

-Técnica:

1.- Con el aplicador de madera se coloca aprox. 1g de materia fecal en el vaso de precipitado, se añaden 10 ml de solución salina y se homogeniza.

2.- Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.

3.-Se centrifuga la suspensión durante 1 minuto a 2,000 rpm.

4.- Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugado, decantando y resuspendiendo las veces necesarias hasta que el sobrenadante sea claro.

5.- Al último sedimento se le agregan 10 ml de solución de formaldehido al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 minutos.

6.- Se añaden después 5 ml de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos.

7.- Se centrifuga durante 2 minutos a 1,500 rpm.

8.- Después de centrifugar se observan 4 capas:

a) Éter en la superficie

b) Un tapón de restos fecales.

c) Formaldehido

d) Sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios.

9.- Se introduce la pipeta Pasteur, a través de las capas a, b y c, hasta la capa d, se extrae un agota del sedimento y se coloca sobre un portaobjetos. Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos se homogeniza, cubriéndolo con el mismo.

10.- Se observa la preparación en el microscopio, con objetivos 10X y 40X.

Informe de resultado.

     Medidas de seguridad:

·        Al mezclar y agitar la suspensión de material fecal con éter, el tubo debe destaparse lentamente, para evitar que el contenido del mismo se proyecte bruscamente hacia el exterior.

·        El área de trabajo deberá estar libre de mecheros encendidos, pues el éter es inflamable.

Indicaciones y limitaciones.

-Es un método con la ventaja de concentrar y no deformar los quistes, huevos y larvas.

- La principal ventaja de esta técnica es su sensibilidad para detectar infecciones leves.

- El uso de formaldehido como fijador, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada.

-Se usa particularmente cuando se necesita una técnica para la evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

Técnica de Gota gruesa

Objetivo y fundamento

El alumno aprenderá la realización de la metodología así  como a la    Identificación de los parásitos presentes en la muestra.

Se fundamenta en la defibrinización  de la sangre y laquear los glóbulos rojos, Ya que  pierden toda la hemoglobina lo que hace que los eritrocitos que están Acumulados se vean como fantasma y de esa manera no permiten la observación De los parásitos

Introducción

La gota gruesa es una técnica de concentración para la búsqueda de Plasmodium Que se encuentra en bajas proporciones.

El diagnóstico microscopio de malaria con una muestra de sangre, gota gruesa extendido fino, está basado en la identificación de los parásitos coloreados libres (gota gruesa) o intracelulares en el eritrocito (extendido fino).los parásitos se identifican por su forma y por la coloración diferencial de sus componentes, es decir, citoplasma, cromatina y pigmento, y se deben distinguir de los elementos formes de la sangre, de otros microorganismos u organismos y de microorganismos o artefactos presentes en la lámina o en el colorante. En vista de que los diferentes  estadios sanguíneos de Plasmodium (trofozoito joven o anillo, trofozoitos en crecimiento, trofozoito maduro, esquizonte inmaduro, esquizonte maduro, gametocitos inmaduros, gametocitos maduros) tienen múltiples y variadas formas, la coloración diferencial es determinante para una correcta identificación. Las coloraciones de giemsa y de Wright tienen colorantes ácidos como la eosina y básicos como el azul de metileno que colorean los componentes celulares acidofilicos respectivamente.

Material y reactivo                          Material.

·        Colorante de giemsa.                      * el habitual en hematología.

·        Metanol Q.P. 200 ml.

·        Aceite de inmersión. 1 ml.

Técnica.

·        Se procede  a hacer el frotis al mismo tiempo y la gota gruesa en el mismo portaobjeto en un extremo de la gota gruesa y el resto en el frotis.

·        Colocar una gota en uno de los extremos del portaobjeto, el Angulo de otro portaobjetos, con el Angulo de otro portaobjetos extender la gota de una manera circular con el fin de desinfibrinar la sangre.

·        Dejar secar y en seguida agregar una gota de agua corriente para blanquear y pintar la sangre.

·        Cuando la gota se observa como una película blanquecina se deja secar nuevamente.

·        Se fija con metanol absoluto, dejar secar

·        Se tiñe con el colorante de giemsa, wraight o may grunwald.

·        Observar con objetivo de inmersión reportar.

Reporte de resultados.

Reportar la fase de género y también si es posible la especie del parásito.

Confiabilidad analítica

La muestra de debe ser observada de manera sistemática, además los portaobjetos deben estar libres de grasa.

A continuacion un vídeo muy interesante sobre el tema de las técnicas parasitológicas.

 

Comentario sobre el tema por parte del equipo

El uso de la tecnología de la información y de la comunicación nos proporciona un gran beneficio, mediante el cual podemos procesar y difundir cualquier tipo de información que deseamos saber o aportar para nuestras tareas. Además agiliza la búsqueda de información  e interpretación, también nos mantiene en contacto con personas especializadas en el tema.

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La tecnología es el mayor apoyo con el que cuenta la ciencia, con la tecnología podemos seguir creando, estudiando, mejorando etc… Y a la vez que la ciencia va mejorándose y descubriendo, esta realiza avances importantes para la creación de nuevas tecnologías.

En nuestro caso nos benefició demasiado, pues de ella nos basamos para recopilar la información que se muestra en este sitio web. 

Por si hay alguna duda y necesitan saber más sobre estos temas aquí están los links de las páginas que se consultaron:

• Manual de practicas de  identificacion de microorganismos con base en tecnicas parasitologicas.
• http://www.uv.mx/personal/sortigoza/files/2011/05/manual_para_gral_2012.pdf
• https://para1.wordpress.com/2008/06/21/metodo-de-concentracion-por-flotacion-willis/
• http://citlaly-parasitologia.blogspot.mx/2011/09/tecnica-de-faust.html
• https://para1.wordpress.com/2008/06/21/metodo-de-concentracion-por-sedimentacion-ritchie/
• http://biologikas.blogspot.mx/2009/01/qu-es-el-examen-de-gota-gruesa.html
• http://www.bvs.hn/Honduras/MetodosKaminsky/N1-KATO2008.pdf